Molekulêre biologiese navorsingsmetodes en die gebruik daarvan

Molekulêre biologiese navorsingsmetodes speel 'n belangrike rol in die moderne medisyne, forensiese wetenskap en biologie. Te danke aan die vooruitgang in die studie van DNA en RNA, die persoon in staat is om die genoom van die organisme te verken bepaal die veroorsakende agent, om die verlangde nukleïensuur in 'n mengsel van sure, ens erken

Molekulêre-biologiese metodes. Wat is dit?

Terug in die 70-80s van die wetenskaplikes was die eerste om te ontsyfer die menslike genoom. Hierdie gebeurtenis het stukrag aan die ontwikkeling van genetiese ingenieurswese en molekulêre biologie. Studie van die eienskappe van DNA en RNA het daartoe gelei dat dit nou moontlik om hierdie nukleïensure gebruik vir die doel van die siekte diagnose, studie gene.

Voorbereiding van DNA en RNA

Molekulêre biologiese diagnostiese metodes vereis begin materiaal: dikwels hierdie nukleïensuur. Daar is verskeie maniere om hierdie stowwe uit die selle van lewende organismes te kies. Elkeen het sy voordele en nadele, en dit moet in ag geneem word by die keuse van 'n metode van isoleer nukleïensure in suiwer vorm.

1. Voorbereiding van DNA deur Marmur. Die metode bestaan in die behandeling van die mengsel van alkohol stowwe, presipiteer as gevolg suiwer DNA. Die nadeel van hierdie metode is die gebruik van bytende stowwe, fenol en chloroform.

2. isolasie van DNA op die boom. Die belangrikste stof wat hier gebruik word - is guanidine thiocyanate (GuSCN). Dit bevorder die afsetting van deoksiribonukleïensuur op gespesialiseerde substrate, waaruit dit dan deur middel van 'n spesiale buffer kan afgehaal word. Maar GuSCN - is 'n inhibitor van die TCP, en selfs 'n klein gedeelte van wat kry gedeponeer in DNA kan die verloop van die polimerase kettingreaksie, wat belangrik is wanneer daar gewerk word met nukleïensure beïnvloed.

3. Neerslag van onsuiwerhede. Die metode verskil van voriges in dat die molekules self nie dehoksiribonukleinovoy suur en onsuiwerhede gedeponeer. Om dit te doen, gebruik die ioon wisselaars. Die nadeel is dat nie alle stowwe kan vestig.

4. Mass vertoning. Hierdie metode word gebruik in gevalle waar jy nie nodig het om akkurate inligting oor die struktuur van die DNA-molekule, en die behoefte om 'n paar statistieke te kry. Die rede hiervoor is dat die nukleïensuur struktuur kan beskadig word tydens die hantering van skoonmaakmiddels, veral alkalieë.

Klassifikasie van navorsingsmetodes

Alle molekulêre-biologiese metodes van navorsing word verdeel in drie groot groepe:

1. Versterking (met behulp van 'n pluraliteit van ensieme). Dit sluit in PCR - polimerase kettingreaksie, wat 'n belangrike rol speel in baie van die diagnostiese metodes.

2. Neamplifikatsionnye. Hierdie groep metodes is direk verband hou met die werk van nukleïensuur mengsels. Voorbeelde hiervan is 3 soorte vlekke, in situ hibridisasie, ens

3. Metodes gebaseer op die erkenning van die sein van die ondersoek molekule, wat bind aan 'n spesifieke DNA of RNA ondersoek. Byvoorbeeld - verbastering stelsel Hybrid-aanjaer Stelsel oplossing (hc2).

Ensieme wat gebruik kan word in molekulêre biologiese navorsingsmetodes

Baie molekulêre diagnostiese tegnieke behels die gebruik van n wye verskeidenheid van ensieme. Hieronder is die mees dikwels gebruik:

1. beperking ensiem - "cut" die DNA molekule om die nodige dele.

2. DNA polimerase - synthesizes n dubbel-gestrand deoksiribonukleïensuur molekule.

3. Reverse transcriptase (trutranskriptase) - gebruik om DNA te sintetiseer uit 'n RNA templaat.

4. DNA ligase - is verantwoordelik vir die vorming van fosfodiësterbindings tussen nukleotiede.

5. eksonuklease - verwyder nukleotiede van die einde gedeeltes van die deoksiribonukleïensuur molekule.

PCR - die basiese metode van DNA versterking

Polimerase kettingreaksie (PCR) is wyd gebruik word in die moderne molekulêre biologie. Hierdie metode, waarin 'n enkele DNA molekule 'n groot aantal kopieë (versterk molekule) verkry kan word.

Die hooffunksies van PCR:

- diagnose van siektes;

- kloning DNA segmente, Gene.

Om uit te voer die polimerase kettingreaksie vereis die volgende elemente: aanvanklike DNA molekule, 'n thermostable DNA polimerase (Taq of Pfu), deoxyribonucleotide fosfate (bronne van stikstof basisse), die primers (2 primer 1 DNA molekule) en self 'n buffer stelsel wat kan voer alle reaksies.

PCR bestaan uit drie stappe: denaturasie, primer uitgloeiing en verlenging.

1. denaturasie. By 'n temperatuur van 94-95 grade Celsius proshodit breek die waterstofbindings tussen die twee kettings van DNA, en as gevolg daarvan kry ons twee enkel-gestrand molekules.

2. uitgegloei primers. By 'n temperatuur van 50-60 grade Celsius plaasvind toetreding primers aan die einde van enkel-gestrand nukleïensuur molekules volgens die tipe van komplementariteit.

3. rek. By 'n temperatuur van 72 grade is gesintetiseer dogter dubbel gestrand deoksiribonukleïensuur molekules.

DNA volgorde

Molekulêre biologiese navorsingsmetodes vereis dikwels kennis van die volgorde van nukleotides in 'n molekule van deoksiribonukleïensuur. Om die vas te stel genetiese kode volgorde. Molekulêre diagnose van die toekoms sal gegrond wees op die kennis opgedoen in die bepaling van die menslike volgorde.

Die volgende tipes volgorde:

• volgorde deur die MAXAM-Gilbert;
• Sanger volgorde;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe volgorde.